第十二章 RNA的生物合成（转录）

第一节 转录系统的组成（模板和酶）
一、概况
（一）相关的概念
1．转录（transcription）——遗传信息从DNA到RNA的转移。
即以双链DNA中的一条链为模板，以4种核苷三磷酸NTP为原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA的过程（包括mRNA、tRNA、rRNA）。
即：把DNA的碱基序列转抄成RNA的碱基序列。
（DNA——决定蛋白质氨基酸序列的原始模板，RNA——蛋白质合成的直接模板）
2．转录与复制的异同

3．DNA分子中的模板链与编码链
（1）模板链（template strand）、转录链、有意义链、信息链、Watson链：
作为模板的DNA链称为模板链、转录链、有意义链或信息链。指引RNA的生成。
（2）编码链（coding strand）非转录链或反意义链、Crick链：
与模板链相对、互补的、不转录的DNA单链。编码RNA的碱基顺序。
合成的RNA碱基顺序与模板链互补，与编码链全等（尿嘧啶U代替胸腺嘧啶T）。

4．不对称转录（asymmetric transcription）
（1）复制是基因组全长DNA的复制，但是半保留。
（2）转录是有选择性的（不对称性的表现或含义）：
? 在细胞的不同发育时期按照生存条件和需要才转录。
? 不是基因组的全长、也不是任何区段都转录。而是只有模板的某个区段转录。
? 同一个区段的同一个时间只有一股链（模板链）可以转录。
文献中DNA序列一般只写出一条编码链，方便查询遗传密码。
（3）结构基因（structural gene）——可以转录出RNA的DNA区段。
（二）转录的方向
在转录过程中，DNA模板被转录方向是从3′端向5′端；但是RNA链的合成方向是从5′端向3′端。

（三）RNA的合成过程（一般分两步）
1．第一步合成原始转录产物（过程包括转录的启动、延伸和终止）。
2．第二步转录产物的后加工，使无生物活性的原始转录产物转变成有生物功能的成熟RNA。
3．但原核生物mRNA的原始转录产物一般不需后加工就能直接作为翻译蛋白质的模板。
二、RNA聚合酶（RNA-pol）（转录酶Transcriptase）
以DNA为模板的RNA聚合酶，也称转录酶。原核生物与真核生物是有区别的。
（一）原核生物的RNA聚合酶
1．酶的分子组成
（1）分子量很大（480kD），通常由5个亚基组成：
两个α亚基、β、β′和σ（sigma）组成五聚体蛋白质，可写作α2ββ′σ。
各亚基比例：α：β：β′：σ==20：10：10：3
（2）全酶：含有5个亚基的酶叫全酶（holoenzyme）。
（3）核心酶：失去σ亚基全酶的叫核心酶（core enzyme）（ααββ′）。

2．RNA聚合酶的作用
催化RNA链的起始与延长。酶所催化的总反应：nNTP→RNAn + nPPi
延长阶段（核心酶）：（RNA）n + NTP + ==（RNA）n+1 + PPi
各组分的作用（见表）

（1）核心酶
试管内的核心酶就能催化RNA的合成（试管内含有模板、酶、底物、NTP）。但是没有固定的起始点，也不能区分双链DNA的信息链与非信息链。
活的细胞转录开始需要全酶。但转录进行到延长阶段则仅需要核心酶。

（2）σ亚基
能识别模板上的信息链和启动子，因而保证转录能从固定的正确位置开始。
σ亚基在转录延长时（首个磷酸二酯键形成后）脱落，所以与转录延长无关。σ亚基可以反复使用。
此亚基目前已经发现多种。通常用分子量区分。
σ⁷⁰（分子量70kD）是典型的辨认转录起始点的蛋白质。
σ³²（分子量32kD）是热休克应答必需的蛋白质。其辨认的热休克基因的启动序列与典型的启动序列（—35和—10）完全不同。
真核细胞普遍存在的热休克基因需要热休克蛋白（Hsp）才能启动，Hsp与原核的σ32在氨基酸组成和排列上高度同源。
（3）β和β′亚基
参与和DNA链的结合。
3．从大肠杆菌E.coli获得的酶，在合成RNA时需要下列成分：
（1）模板
首选的模板是双链DNA。但单链DNA亦可作为模板。
RNA不论是单链或双链以及RNA-DNA杂交链都不是有效的模板。
（2）活化前体
需要所有四种核苷三磷酸——ATP，GTP，UTP及CTP。
二价金属离子——Mg2+或Mn2+都有效。在体内则要求Mg2+。
所有原核生物的RNA聚合酶在结构、组成、功能上都与大肠杆菌E.coli的RNA聚合酶相似，并且都受利福平或利福霉素的特异性抑制（专一性结合β亚基）。
（二）真核生物RNA聚合酶
1．种类（三种）：
RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（不包括真核线粒体的RNA聚合酶）。
三种酶分别专一性地转录不同的基因、产生不同的产物。
三种酶对真核生物转录酶的特异性抑制剂（鹅膏蕈碱、鹅膏菌素）的反应也不同。

2．分子组成
真核生物转录酶由8～12个亚基组成，分子量高达80万。
电泳分析显示，有些亚基是两种酶共有的，有些亚基是三种酶共有的。共有的亚基分子量低于40kD。
其中分子量为138，750的亚基的一级结构与原核的β亚基有高度的同源性。
初步的研究指出，它们也可能存在类似原核的σ亚基组分。
3．催化的反应：
nNTP→RNAn + nPPi
第二节 转录过程——包括启动、延伸和终止
一、转录开始——启动
原核与真核生物有所不同。
（一）原核生物的转录起始
1．酶与模板（启动子或启动序列）的辨认结合
（1）RNA聚合酶结合启动子（序列）
RNA聚合酶的σ因子正确识别DNA模板上的启动子（promotor）（序列）并与之结合。
（2）启动子（序列）
转录单位（操纵子）结构基因上游调控序列中与转录酶结合的部位。

（3）对启动子的研究方法——共有序列或保守序列
1）分离某段基因（脱氧核糖核酸）并与纯的RNA聚合酶（蛋白质）混合
2）加入核酸外切酶（胰DNA酶）水解
3）分离未被水解的基因（被RNA聚合酶结合而保护的区域）

4）分析保护区（40——60bp）的碱基序列
将用胰DNA酶消化时得到RNA聚合酶全酶保护的DNA片段加以分离并测定其碱基顺序。另一方法是借增加或减少特定基因的转录来分析某些变种。

这些研究表明：
起动部位含有约40碱基对，它相当于约140?（14nm，相当于4个双螺旋，4个螺距）长的DNA片段。
对大肠杆菌及噬茵体DNA的各种起动子的分析提示，在mRNA开始点前的10个碱基对左右，有个7碱基对序列，它是识别信号的关键部分。
另一识别部位距mRNA起始点前约35碱基处，可能与RNA聚合酶的开始结合有关。
（4）启动子的结构特点
一般位于转录起点上游常有一致性序列：-35bp区附近是-TTGACA-；-10bp区是-TATAAT-（Pribnow box）。如上图。
（注：“转录生成的mRNA的5/端第一核苷酸位置为1”，但是往往并不是翻译的起点。）
σ因子识别转录起始点时辨认并结合的DNA区段就是-35区的-TTGACA-（结合疏松），随即酶移向-10区的-TATAAT-，此时已经跨入转录起始点。

2．形成三元起始复合物
形成由酶、DNA、pppGpN—OH构成的三元起始复合物。
转录即自此开始。

转录起始复合物 = RNA聚合酶（全酶）—DNA—pppGpN—OH
1）复合物中的核苷三磷酸一般为GTP，少数为ATP。因而原始转录产物的5′端通常为三磷酸鸟苷（pppG）或腺苷三磷酸（pppA）。
2）第一个核苷三磷酸与第二个核苷三磷酸缩合生成3′-5′磷酸二酯键后，则启动阶段结束，进入延伸阶段。此时σ因子从起始复合物上脱离，仅剩核心酶连同四磷酸二核苷酸，继续结合于模板上沿模板前移（如果σ因子不脱落则RNA-pol停留在起始位置），形成转录空泡。RNA的5/端结构在整个转录过程保留（5/-pppGpN-）。
（二）真核生物的转录起始——RNA聚合酶辨认结合启动子，形成起始复合物
1．真核基因上与转录起始有关的上游序列——顺式作用元件
注意：真核DNA上的转录启动区域有类似原核DNA的启动区结构：在-30bp（即在上游30核苷酸处，常以—30表示，bp为碱基对的简写）附近也含有TATA结构，称霍格内斯（Hogness）盒或TATA盒，但没有原核的典型。也可以没有TATA盒。
典型的真核生物基因上游序列（顺式作用元件）如下图：RNA-pol Ⅱ转录的基因

2．真核生物细胞与转录起始有关的转录调节因子
在真核生物细胞，RNA-pol不能直接与DNA分子结合，必须依靠蛋白因子。
能直接或间接辨认、结合转录上游区段的蛋白质有多种，统称为反式作用（trans-acting factor）。因子与因子之间也需要互相辨认结合，以准确地控制基因是否转录以及何时转录。
反式作用因子中能直接或间接结合RNA-pol的，则称为转录因子（transcriptional factor，TF）。根据酶的不同，转录因子又分为TFⅠ、Ⅱ、Ⅲ，下面又分许多亚型。
相应于RNA-polⅡ的TFⅡ的性质与功能如下表。

3．真核生物的转录起始复合物
（1）转录前起始复合物（pre-initiaction complex，PIC）的形成
TATA→TFⅡD→TFⅡA→TFⅡB→RNA-polⅡ/ TFⅡF→TFⅡE→PIC

（2）稳定的转录起始复合物的形成
结合了增强子的转录激活因子（增强子结合蛋白，EBP）与PIC中的TFⅡD接近或通过TBP相关因子（TAF）与TFⅡD联系，形成稳定的转录起始复合物。

二、延伸——形成转录空泡（transcription bubble）（转录复合物）：
在原核与真核没有太大的区别，只是RNA-pol不同。
转录空泡（转录复合物） = 核心酶 + DNA模板 + 转录产物RNA
转录与复制一样需要模板解开成单链，范围需要10——20（17）核苷酸或碱基。

上图为原核生物的转录空泡（转录复合物）。

注意：
有时同一条DNA分子上可以同时有多个转录空泡（电镜下呈羽毛状）。原核转录与翻译是同时进行的。

（一）方向
σ亚基脱离酶分子，留下的核心酶与DNA的结合变松，因而较容易沿模板3/→5/方向继续往前移动合成新链（RNA合成方向为5/→3/）。模板不断解链，转录空泡不断向前移动。
（二）酶
核心酶无模板专一性，能转录模板上的任何顺序，包括在转录后加工时待切除的居间顺序。脱离核心酶的σ亚基还可与另外的核心酶结合，参与另一转录过程。
（三）模板
随着转录不断延伸，DNA双链顺次地被打开，并接受新来的碱基配对，合成新的磷酸二酯键后，核心酶向前移去，已使用过的模板重新关闭起来，恢复原来的双链结构。

（四）保真性：一般合成的RNA链对DNA模板具有高度的忠实性。
（五）RNA合成的速度：原核为25～50个核苷酸／秒，真核为45～100个核苷酸／秒。
三、终止
转录的终止包括——停止延伸及释放RNA聚合酶和合成的RNA。
（一）原核生物细胞的转录终止（根据是否需要Rho蛋白分2种）
1．非依赖Rho（ρ因子）的转录终止
DNA模板上含有终止信号或终止序列——终止子。终止子对应的转录产物RNA可以形成特殊的结构——茎-环结构（发夹）终止转录。
（1）结构的共同特点：在终止信号前的富含GC区域后面，总有一富含AT序列跟随着。
（下图：大肠杆菌色氨酸操纵子转录终止信号区的碱基顺序）。

终未序列最突出的特点是它的富含GC区有二重对称性，使这个区域的RNA转录产物有自身互补性，能形成茎环（stemloop）或发夹（hairpin）状结构，使RNA-pol脱落。

（2）茎环结构终止转录机制
1）茎环结构在RNA分子中形成，可以改变RNA-pol的构象及其与DNA模板的结合方式，造成酶不再向下游移动，出现转录停顿与终止。
2）转录复合物上局部存在的DNA-RNA杂化双链由于RNA自身的局部双链（茎环）和DNA部分回复双螺旋而变短，杂化双链变的不稳定，转录复合物趋于解体。
3）DNA模板中富含AT区域的一系列碱基所决定的末端连续的寡聚U促进RNA链从模板脱落。因为所有的碱基配对中rU：dA最不稳定。

当RNA聚合酶遇到一处或多处这种结构特点时，就会停顿下来。
在某些终止位点上，新生的RNA链不需其他蛋白质的协助就获得释放。在另外一些位点上，链的终止需要rho蛋白参与。
2．依赖Rho因子（ρ因子）的转录终止
原核细胞转录终止需要一种终止因子ρ（六个亚基构成的蛋白质，分子量64kD）。
Rho具有结合RNA的能力，并且对polyC（非poly dC/dG）的结合力最强。并且还有ATP酶和解螺旋酶的活性。

（1）当转录产物的3末端含有丰富的C（或有规律地出现）时，就会与Rho结合使二者都发生构象的变化，从而使RNA聚合酶停顿。
（2）解螺旋酶活性使DNA-RNA杂化链分开释放RNA产物，转录终止。

（二）真核细胞转录的终止——与转录后的加工修饰关系密切
1．真核生物DNA上也可能有转录终止的信号，称为转录终止的修饰点。

已知真核DNA转录单元（读码框架）的3′端均含富有AT的序列（如AATAAA或ATTAA）A等），在相隔0～30bp之后又出现TTTT顺序（通常是3～5个T），这些结构可能与转录终止或者与3′端添加多聚A顺序有关。
2．转录越过转录修饰点后的RNA在修饰点被切断，随即“加尾”、“戴帽”。余下的RNA继续转录，但产物很快被RNA酶水解。
第三节 真核生物转录产物的转录后修饰
一、mRNA前体的后加工
原核mRNA的原始转录产物（除个别噬菌体外）都可直接用于翻译，而真核mRNA一般都有相应的前体，前体必须经过后加工才能用于转译蛋白质。
一般认为，真核mRNA的原始转录产物（也称原始转录前体）核不均一RNA（hetero-geneous nuclear RNA，hn RNA），最终被加工成成熟的mRNA。mRNA前体的后加工包括以下四方面。
（一）首尾的修饰
1．装上5′端帽子——在细胞核内完成：
转录产物的5′端通常要装上甲基化的帽子（GpppmG—）；有的转录产物5′端有多余的顺序，则需切除后再装上帽子。
5′三磷酸鸟苷→5′一（二）磷酸鸟苷→三磷酸双鸟苷→7-甲基鸟嘌呤-三磷酸鸟苷。

下图是几种帽子结构的形式。

注：第一个甲基化（G的N7位）称为帽0；也可以发生在两个G之间的核糖上。或在第二碱基（多是G）称为帽1。也可以在多个位点上（帽3）。
2．装上3′端多聚A尾巴——在核内完成，与转录终止同步：
转录产物的3′端通常由多聚A聚合酶催化加上一段多聚A（不依赖模板），多聚A尾巴的平均长度在20～200个核苷酸；有的转录产物的3′端有多余顺序，则需切除后再加上尾巴。
装5′端帽子和3′端尾巴均可能在剪接之前就已完成，先于中段剪接。

（二）真核mRNA的剪接
1．hnRNA和snRNA：
（1）杂化核RNA（hetero-nuclear RNA ，hnRNA）：
核内初级转录产物，是mRNA的前体。

下图为鸡卵清蛋白成熟mRNA与基因DNA分子杂交后电镜所见。7个内含子（鼓泡状突出部分）将8个外显子分开。

（2）小型核内RNA（small-nuclear RNA ，snRNA）：
100—300核苷酸组成，有U1、U2、U4、U5、U6等类别。
并接体（splicesome）：snRNA与核内蛋白质组成的核糖核酸蛋白体（本身有酶活性）。
并接体可以结合在hnRNA内含子区段并使内含子弯曲、两断接近（成套索形状，即lariat RNA中间体），利于剪接。
2．断裂基因（splite gene）、外显子（exon）、内含子（intron）
真核的结构基因由若干编码区（外显子）核非编码区（内含子）互相间隔、连续镶嵌组成，编码一个由连续氨基酸组成的完整蛋白，故称为断裂基因。
下图：胰岛素基因、转录产物、翻译产物

（斜线：内含子、S：信号肽、Pre：前导序列、C：C肽、A、B：胰岛素的亚基）

注：涂黑处为前导顺序（L）和外显子（1、2、3、4、5、6、7）。
3．mRNA的剪接——除掉内含子、连接外显子（两次转酯反应）
（1）内含子结构特点（多数）
1）剪接接口（splicing junction）或边界序列：5′-GU????????AG-OH 3′
2）内含子靠近3′端有一个甲基化的嘌呤核苷酸：如3mG，是形成套索的关键所在。
（2）剪接过程：
1）并接体与hnRNA结合

2）第一次转酯反应
3）第二次转酯反应

4．修饰：
mRNA分子内的某些部位常存在甲基腺苷（见核苷酸），它是由甲基化酶催化产生的，也是在转录后加工时修饰的。
有的真核mRNA前体，由于后加工的不同可产生两种或两种以上的mRNA（如人的降血钙素基因转录产物），因而能翻译成两种或两种以上的多肽链。

（三）内含子的其它剪接方式
内含子的分类——两种方法
1．按基因类型——分四类
（1）第Ⅰ类：线粒体、叶绿体、低等真核生物——rRNA的基因
（2）第Ⅱ类：线粒体、叶绿体——mRNA的基因
以上两类有一部分是RNA分子本身起酶的作用催化自身剪接。
（3）第Ⅲ类：多数mRNA的基因，形成套索后剪接。
（4）第Ⅳ类：tRNA的基因及其初级转录产物中的内含子。剪接过程需要酶和ATP。
2．按中断基因线性表达的方式——分三种
（1）翻译前删除内含子：典型的、常见的内含子。在RNA加工中除去。
（2）翻译绕过式内含子：不被剪接删除，但一般不翻译。特定条件下除外。
（3）翻译后删除内含子：把翻译后的加工也算入内含子的概念中。如胰岛素的C肽。
二、tRNA前体的后加工
（一）tRNA前体的后加工的内容
1．切除多余的顺序
（1）含单个tRNA的tRNA前体：在5′端和3′端各有一段多余顺序。
（2）含二个tRNA的tRNA前体：5′端和3′端有长短不一的多余顺序，在两个tRNA之间还有数目不等的核苷酸隔开。
（3）有的真核tRNA前体的反密码子环区含有一个居间顺序。

2．各种稀有碱基的生成
（1）甲基化：如tRNA甲基转移酶催化的反应：嘌呤→甲基嘌呤。
（2）还原反应：U→DHU。
（3）核苷内转位反应：尿嘧啶核苷→假尿嘧啶核苷（ψ）。
（4）脱氨基反应：A→I。
3．在3′同一加上-CCA-OH末端，完成柄部结构，核苷酸转移酶作用
（二）tRNA的剪接过程——需要酶和ATP
内含子的核酸内切酶是由tRNA基因的内含子编码的。
以下实验可以推论和证实tRNA的剪接是需要酶的：成熟的tRNA能竞争性地抑制tRNA的剪接，这是酶促反应的特征之一。tRNA的成熟过程对温度敏感。

（三）原核和真核生物tRNA前体的后加工的异同
1．相同点——修饰：
（1）对tRNA分子上的部分核苷酸进行修饰（包括甲基化、酰化、硫代和重排等）；
（2）切除5′端和3′端多余核苷酸；
（3）3′端不含CCA顺序的tRNA前体需装上CCA顺序。
有些tRNA的-CCA-OH原本存在，但是需要专一性的酶处理以后方能暴露。
2．区别
（1）原核多顺反子tRNA前体，需加工时切开；
（2）含有居间顺序的真核tRNA前体，加工时需除去居间顺序：
①首先，tRNA前体被一内切核酸酶将居间顺序切除，产生带有2′，3′-环磷酸的5′半分子和含有5′羟基的3′半分子；
②然后两个半分子分别在2′，3′-环磷酸二酯酶和多核苷酸激酶作用下使5′半分子露出了羟基和2′磷酸基，使3′半分子带上5′磷酸基；
③这两个半分子再先后经过连接酶和磷酸单酯酶（去除2′磷酸基）的作用，最后生成成熟的tRNA。
三、rRNA前体的后加工
（一）真核rRNA的基因（rDNA）特点
1．属于丰富基因（redundant gene）族的DNA序列：
染色体上一些相似或完全相同的纵列串联基因（tandem gene）单位的重复。
这些单位由不能转录的间隔（spacer）区（不同于内含子）把可以转录的片段分隔组成。
注：同属于丰富基因族的还有：
5S-rRNA、组蛋白基因、免疫球蛋白基因、糖代谢酶基因？
2．属于高度重复序列（highly repeat sequence;highly repetitive sequence）DNA。
不同种属的rDNA大小不一，重复单位数目不同（百~千）、每个重复单位中可转录片段的大小不同（7~13kb），间隔区为几千bp。最后转录出的rRNA大小相同。
3．rDNA位于核仁，自成一组转录单位。
转录产物是45S的三种rRNA的前身。剪接后生成18S-rRNA、5.8S-rRNA、28S-rRNA。
（二）rRNA前体的加工
1．修饰：
除5SrRNA外，rRNA分子上通常有修饰核苷酸（主要是甲基化核苷酸），它们都是在后加工时修饰的。一般认为核糖2′羟基的甲基化在碱基甲基化之前；
2．剪切：
在rRNA前体分子的多余顺序处切开，产生许多中间前体，然后再切除中间前体末端的多余顺序（下图：真核rRNA前体加工示意）。

3．剪接：
有的真核生物rRNA前体中存在有居间顺序的，须加工时除去。1982年T.R.切赫发现，在四膜虫（Tetrahymena）rRNA前体中，去除含有413个核苷酸的居间顺序是由rRNA前体自身催化完成的。

在5′-鸟苷酸的促进下经过自身催化作用将居间顺序切除，居间顺序前后的两个部分再连接起来，产生成熟的rRNA（5′-UpU-3′）和一个环状RNA分子及一个15个核苷酸残基的小片段。
rRNA前体的自身催化作用不需要任何蛋白质参加，表明RNA具有类似于酶的活性。
具有酶活性的RNA命名为核酶（ribozyme）。核酶的基本结构——槌头结构。
这一发现突破了生物高分子中只有蛋白质才有催化作用的观念。同时对生物进化与生命起源等研究都将有重要的意义。
由于核酶结构的阐明，可以人工设计核酶。

四、转录抑制剂
转录能被一些特异性的抑制剂抑制，有些抑制剂是治疗某些疾病的药物，有的则是研究转录机理的重要试剂。按照作用机理的不同，转录抑制剂分为两大类。
第一类抑制剂特异性地与DNA链结合，抑制模板的活性，使转录不能进行。这类抑制剂同时抑制DNA复制，例如：放线菌素D、纺锤菌素、远霉素、溴乙锭和黄曲霉素等。
第二类抑制剂作用于RNA聚合酶，使RNA聚合酶的活性改变或丧失，从而抑制转录的进行。这类抑制剂只抑制转录，不影响复制，是研究转录机制和RNA聚合酶性质的重要工具。