第二章 蛋白质的结构与功能
第一节 概述
生命——以物质为基础构成的一种特殊形式。
现代生物化学与分子生物学的研究与实践表明，蛋白质与核酸是生命活动过程中最重要的物质基础。
蛋白质在生命活动中的重要性，主要表现以下方面：
一、蛋白质是构成生物体的基本成份
蛋白质（protein，源自希腊字Proteios，意为primary，是原生质的代名词）在生物界的存在具有普遍性，无论是简单的低等生物，还是复杂的高等生物，如病毒、细菌、植物和动物等，都毫无例外的含有蛋白质。越高等的生物，其蛋白质的种类、结构与功能越复杂。
蛋白质不仅是构成一切细胞和组织的重要组成成份，而且也是生物体内含量较多的高分子有机化合物。
通常将这些构成组织细胞成分的蛋白质，称为结构蛋白。
人体内蛋白质——含量约占人体总固体量的45％(某些细胞可以达到干重的70%)，肌肉、内脏和血液等都以蛋白质为主要成份；
微生物——蛋白质含量亦高，细菌中一般含50一80％，干酵母含46．6％，病毒中除少量核酸外。其余几乎皆为蛋白质；
高等植物——细胞原生质和种子中也含有较多的蛋白质，如黄豆几达40％。
器官或组织 |
蛋白质含量 |
器官或组织 |
蛋白质含量 |
液体组织 |
85 |
心脏 |
60 |
脾脏 |
84 |
肝脏 |
57 |
肺脏 |
82 |
胰脏 |
47 |
横纹肌 |
80 |
脑神经 |
45 |
肾脏 |
72 |
骨骼 |
28 |
消化道 |
63 |
脂肪组织 |
14 |
二、蛋白质具有多样性的生物学功能，是生命活动的物质基础
（一）自然界蛋白质的种类繁多：
大肠杆菌——有3000种不同的蛋白质；
人体——有l0万种以上不同的蛋白质；
而整个生物界——蛋白质的种类数约为1010数量级。
这些不同结构的蛋白质，各具不同的生物学功能，它们与不同生物的生命活动有极为密切的关系；几乎所有重要的生命现象和生理活动往往都是通过蛋白质来实现的。
常将这些蛋白质称为功能性蛋白。
1．生物催化作用
生命的基本特征是物质代谢，物质代谢的全部生化反应几乎都需要酶作为生物催化剂。已知有2000种以上的酶，它们的化学本质毫无例外地都是蛋白质。正是这些酶类决定了生物代谢的类型，从而才有可能表现出各种生命现象。
2．代谢调节作用
生物体存在着精细而有效的物质代谢调节机构，以维持正常的生命活动。参与代谢调节的许多激素是属于蛋白质或多肽类物质，如胰岛素、生长激素、胸腺素及各种促激素等。胰岛素可调节血糖的水平，若分泌不足可导致糖尿病。
3．免疫保护作用
机体的免疫功能与抗体有关，而抗体是一类特异的球蛋白。它能识别进入体内的异体物质，如细菌、病毒和异体蛋白等，并与其结合而失活，使机体具有抵抗外界病原侵袭的能力。免疫球蛋白也可用于许多疾病的预防和治疗。
4．物质的转运与贮存
体内许多小分子物质的转运与贮存可由一些特殊的蛋白质来完成。
如血红蛋白运输氧和二氧化碳；
血浆运铁蛋白转运铁，并在肝形成铁蛋白复合物而贮存；
不溶性的脂类物质与血浆蛋白结合成脂蛋白而运输。
许多药物吸收后也常与血浆蛋白结合而转运。
5．运动与支持作用
肌肉的收缩与舒张是由肌动蛋白与肌球蛋白等完成。这是躯体运动、血液循环、呼吸与消化等机能活动的基础。
皮肤、骨骼和肌腱的胶原纤维主要含胶原蛋白，它有强烈的韧性，1mm粗的胶原纤维可耐受10一40kg的张力，从而保证了这些组织的功能。
6．生长、繁殖、遗传和变异作用
生物的生长、繁殖、遗传和变异等都与核蛋白有关，而核蛋白是由核酸与蛋白质组成的结合蛋白。再者，遗传信息多以蛋白质的形式表达出来。
组蛋白和阻遏蛋白等参与细胞生长与分化的调节。
7．生物膜的功能和受体
生物膜的基本成份是蛋白质和脂类，它和生物体内物质的转运有密切关系，也是能量转换的重要场所。
受体也是一类蛋白质，它接受和传递调节信息。如细胞膜上蛋白质类激素受体、细胞内团体激素受体，以及一些药物受体等。
其它还有眼视网膜上感光的视蛋白，味蕾上的味觉蛋白，参与凝血的纤维蛋白原等。
近来分子生物学研究表明，在高等动物的记忆相识别功能方面，蛋白质也起着十分重要的作用。
此外，有些蛋白对人体是有害的，称为毒蛋白，如细菌毒素、蛇毒蛋白、蓖麻子的蓖麻蛋白等，它们侵入人体后可引起各种毒性反应，甚至可危及生命。
生命活动是不可能离开蛋白质而存在的。因此，有人称核酸为“遗传大分子”，而把蛋白质称作“功能大分子”。
三、供给能量
每1克蛋白质在体内氧化分解提供的能量约为417KJ（kcal），也是能量的一种来源。但体内能量的来源主要靠糖和脂肪氧化分解供给。也就是说，蛋白质的供能作用可由糖和脂肪代替，故供给能量是蛋白质的次要功能。前两者才是蛋白质的主要功能。
在药学领域，人类早在古代就已利用动物脏器来防治疾病。近代，人们已大规模地生产相应用生化药物，这类药物大多从动植物和微生物提取制备，其有效成份许多为蛋白质或多肽（如酶类，一些激素等）；即使有效成份本身并非蛋白质，但由于它们在组织细胞内与大量蛋白质共同存在，在提取，分离时也必然遇到有关蛋白质的处理问题。
因此，蛋白质的研究不仅具有重要的生物学意义，而且对有关药物的生产、制备、分析、贮存和应用等也都具有重要的现实意义。
第二节 蛋白质的化学组成
蛋白质在生命活动中的重要功能有赖于它的化学组成、结构和性质。
一、蛋白质的元素组成
蛋白质不仅在功能上与糖、脂肪不同，在元素组成上亦有差别。
根据对蛋白质的元素分析表明，其元素组成依次为：
碳（50-55%）
氧（19-24%）
氮（13-19%）
氢（6-7%）
硫（0-4%）
有的还含有少量磷、铁、铜、锌、锰、钴、钼、碘等元素。
一切蛋白质皆含有氮并且大多数蛋白质含氮量比较接近而恒定，一般为15—17％，平均为16％。这是蛋白质元素组成的一个重要特点，也是各种定氮法测定蛋白质含量的计算基础。即用定氮法测得的含氮量乘以6．25，即可算出样品中蛋白质的含量。
蛋白质的含量＝蛋白质含氮量×100/16＝蛋白质含氮量×6．25
二、蛋白质结构的基本单位——氨基酸（amino acid）
蛋白质是高分子有机化合物、结构复杂、种类繁多，但其水解的最终产物都是氨基酸。因此，把氨基酸称为蛋白质结构的基本单位。
（一）、蛋白质的水解
将蛋白质完全水解成氨基酸，对研究蛋白质的组成和氨基酸的制备都是必要的手段之一。水解的方法有酸水解、碱水解、酶水解三种，各有其特点。
1．酸水解法
这是蛋白质水解常用的方法。一般是将蛋白质加6mo1/L的盐酸，于110℃加热回流16—24小时，或加压于120℃水解12小时。
此法的优点是：
水解完全，盐酸可加热除去，水解过程不引起氨基酸发生旋光异构作用，仍为L-型氨基酸。
主要缺点：
是营养价值较高的色氨酸几乎全被破坏；含羟基的氨基酸部份遭破坏；一些水解产物可与醛基化合物作用生成一类黑色物质而使水解液呈黑色。
2．碱水解法
蛋白质加6mo1/L的Na0H或4mo1/L的Ba(OH)2煮沸6小时，即可完全水解。
本法的优点：
是色氨酸不受破坏，水解液清亮。
严重的缺点：
是氨基酸发生异构化作用，产物有L-型和D-型（二者等量，为混合消旋体），而D-型氨基酸不能为人体所利用；一些氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸等大部份遭破坏，并释出NH3和硫化物。故本法较少使用。
3．蛋白酶水解法
一般用胰酶、胰浆或微生物的蛋白酶类等。本法的优点是条件温和，缺点是酶较昂贵。
(二)、氨基酸的结构
自然界的氨基酸超过300种，但是组成人体蛋白质的氨基酸有20种，可以看作是羧酸分子中α-碳原子上的氢原子被氨基取代而成的化合物，均属于α-氨基酸，即其氨基和羧基都连接在α-碳原子上。
氨基酸碳链表示：
其结构可用下列通式表示：
R表示不同的侧链基团，R不同代表不同的氨基酸。
各种氨基酸在结构上有下列共同特点：
1．组成蛋白质的氨基酸皆为α-氨基酸。
既具有酸性的羧基（-COOH），也具有碱性的氨基（-NH2）。因此氨基酸是两性电解质，它在溶液中的带电情况，随溶液的pH值而变化。
由这些氨基酸构成的蛋白质同样具备两性电离的特点。
2．不同的α-氨基酸，其R侧链不同（氨基酸分类的依据）。
它对蛋白质的空间结构和理化性质有重要的影响。
3．除R侧链为氢原子的甘氨酸外，其它氨基酸的α-碳原子所连接的四个原子或基团互不相同，该碳原子都是不对称碳原子。
4．20种氨基酸中的脯氨酸含有亚氨基，所以它是亚氨基酸。半胱氨酸在蛋白质分子中多数是以胱氨酸的形式存在。
（三）氨基酸的构型
1、D、L—相对构型
氨基酸中的不对称碳原子键合的四个取代基各不相同：羧基、氨基、R基和一个氢原子。
该碳原子周围的价键是取四面体的排布，这样，四个不同的取代基在空间的排列可以有两种不同的方式：
L-型和D-型，它们彼此是一种不能叠合的物体与镜象关系或左右手关系。由于氨基酸分子结构的不对称性而具有旋光性质（旋光异构现象）。
D、L构型是各种氨基酸分子中连接在α-碳原子上四个不同基团的空间排列与L-甘油醛（L-glyceraldehyde）或者L-乳酸的构型相比较而得出的相对构型。
凡氨基在α-碳原子左侧者为L型，在右侧者为D型。
目前已知的天然蛋白质中的氨基酸除甘氨酸外都属于L-型，故称为L-型α-氨基酸。
自然界的D-氨基酸大多数存在于某些细胞产生的抗生素及个别的植物的生物碱中。
(四)、氨基酸的分类
1．营养学分类
可将氨基酸分为两类：必需氨基酸和非必需氨基酸。
不能在体内合成，必须由食物提供的氨基酸称为必需氨基酸。20种氨基酸中只有赖、色、苯丙、甲硫、苏、亮、异亮、缬氨酸是体内不能合成的，故这八种氨基酸是必需氨基酸。
能够在体内合成的氨基酸称非必需氨基酸。
2、根据侧链R基团的结构和性质作为氨基酸分类的基础。
蛋白质的许多性质，结构和功能等在很大程度上与氨基酸的侧链R基团密切相关。
（1）酸性氨基酸——谷氨酸Glu和天冬氨酸Asp
其R基团含羧基，在pH7时，羧基可解离而使分子带负电荷。
游离或在蛋白质中都带负电荷，以酸根形式存在。在蛋白质中与正电基团形成盐键。
（2）碱性氨基酸——赖氨酸Lys、精氨酸Arg和组氨酸His
其R基团含碱性基团，在pH7时，这些基团可质子化而使分子带正电荷。
（3）非极性疏水性氨基酸
其R基团无极性、不解离，且为疏水性的。有7种：
脂肪族氨基酸5种(甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、缬氨酸Val、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile)
芳香族氨基酸1种(苯丙氨酸Phe)；
杂环氨基酸1种（脯氨酸Pro）。
注：甘氨酸具有一定的亲水性。
（4）不解离的极性氨基酸（极性非电离氨基酸）——羟基氨基酸+巯基氨基酸+甘氨酸
其R基团虽有极性但不能解离。有8种：
即含羟基氨基酸(丝氨酸Ser、苏氨酸Thr和酪氨酸Tyr)；含巯基的半胱氨酸Cys；
酰胺类氨基酸(谷氨酰胺Gln和天冬酰胺Asn)；色氨酸Tre和蛋氨酸Met；
注：蛋氨酸和色氨酸也具有一定的疏水性（侧链有极性基团）。
另外，酪氨酸在高pH环境还可以解离出H+。
（5）蛋白质中少见的氨基酸——无遗传密码，来自翻译后加工修饰。
3．根据氨基酸结构分类：
（1）脂肪族氨基酸：Gly 、Ala 、Val、Leu、 Ile、Pro
侧链增大时疏水作用增强。
（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp（含有较大的吲哚环）
（3）羟基氨基酸、含硫氨基酸：Ser、Thr、Cys、Met
（4）酸性氨基酸及其酰胺：Asp、Glu、Asn、Gln
（5）碱性氨基酸：Lys、Arg(常结合氢带正电呈碱性，易于形成盐键)、His(参与质子传递)。
中文名称 |
英文名称 |
三字缩写 |
一字符号 |
等电点 |
甘氨酸 |
glycine |
Gly |
G |
5.97 |
丙氨酸 |
alanine |
Ala |
A |
6.00 |
缬氨酸 |
valine |
Val |
V |
5.96 |
亮氨酸 |
leucine |
Leu |
L |
5.98 |
异亮氨酸 |
isoleucine |
Ile |
I |
6.02 |
苯丙氨酸 |
phenylalanine |
Phe |
F |
5.48 |
脯氨酸 |
proline |
Pro |
P |
6.30 |
色氨酸 |
tryptophan |
Trp |
W |
5.89 |
丝氨酸 |
serine |
Ser |
S |
5.68 |
酪氨酸 |
tyrosine |
Tyr |
Y |
5.66 |
半胱氨酸 |
cysteine |
Cys |
C |
5.07 |
蛋氨酸 |
methionine |
Met |
M |
5.74 |
天冬酰胺 |
Asparagines |
Asn |
N |
5.41 |
谷氨酰胺 |
glutamine |
Gln |
Q |
5.65 |
苏氨酸 |
threonine |
Thr |
T |
5.60 |
天冬氨酸 |
aspartic acid |
Asp |
D |
2.97 |
谷氨酸 |
glutamic acid |
Glu |
E |
3.22 |
赖氨酸 |
lysine |
Lys |
K |
9.74 |
精氨酸 |
arginine |
Arg |
R |
10.76 |
组氨酸 |
histideine |
His |
H |
7.59 |
（五）氨基酸的理化性质
1、两性解离及其等电点
（1）氨基酸是两性电解质：
氨基酸既含羧基,又含氨基,同时能起酸和碱的作用，是两性电解质，在水溶液中主要以兼性离子（偶极离子）的形式存在。
（2）氨基酸的等电点：
在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阴、阳离子的趋势和程度相等而成为兼性离子，呈电中性时溶液的pH称为该氨基酸的等电点（isoelectric point，pI）。
侧链不同，解离的趋势也不同，并且解离方式取决于所处溶液的酸碱度。
氨基酸完全质子化的时候可以看作是多元酸。
侧链不解离的中性氨基酸可看作是二元酸，酸性和碱性氨基酸可以看作是三元酸。
（3）等电点的计算：
氨基酸的等电点由α-羧基和α-氨基的解离常数的负对数pK1和pK2决定：
如：丙氨酸pK-COOH=2.34，pK-NH2=9.69；则：
pI=1/2（2.34+9.69）=6.02
如果氨基酸有3个可以解离的基团，则写出电离式后取兼性离子两边的pK值的平均值，即为此氨基酸的pI值。
如天冬氨酸等电点计算：pK1=2.09、pK2=3.86、pK3=9.82
pI=1/2(pK1+pK2)=1/2(2.09+3.86)=2.98
又如：赖氨酸等电点计算：pK1=2.18、pK2=8.95、pK3=10.53
pI=1/2(pK1+pK2)=1/2(8.95+10.53)=9.74
pI=1/2(pKn+pKn+1) n为氨基酸在酸性所带最大正电荷数（完全质子化）。
注：计算等电点首先要知道结构式，其次知道解离顺序。
写出解离式（从完全质子化一侧开始向完全非质子化一侧进行）。
2、紫外吸收性质
20种氨基酸在可见光区无吸收。在远紫外区：＜220nm都有光吸收。
在近紫外光区（220-300nm）只有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸有吸收。
摩尔消光系数ε分别为：
苯丙氨酸λmax=257（ε257=2.0×102）
酪氨酸λmax=275（ε275=1.4×103）
色氨酸λmax=280（ε80=5.6×103）
色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰都在280nm附近。
由于大多数蛋白质中含有色氨酸和酪氨酸残基，所以可以测定蛋白质溶液的280nm的光吸收值对蛋白质进行定量的分析。
3、茚三酮反应
氨基酸与茚三酮水合物共热生成蓝紫色化合物，在570nm处有最大吸收峰，可以作为定量测定氨基酸的方法。
三、肽
（一）肽键与肽链
1、肽键（peptide bond）：
一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的共价键（-CO—NH-）称为肽键，又称酰胺键。蛋白质分子中的氨基酸通过肽键连接。
2、肽（peptide）：
氨基酸通过肽键连接起来的化合物称为肽。
通常将十肽以下者称为寡肽（oligopeptide），十肽以上称为多肽。
多肽是链状化合物，也可以称为多肽链（polypeptide chain）。
注意：蛋白质与多肽在分子量上无法区分。习惯上：
促肾上腺皮质激素（39肽）——多肽，
胰岛素（51肽）——蛋白质
3、氨基酸残基（residue）：
氨基酸在形成肽链后，因有部分基团参加肽键的形成，已经不是完整的氨基酸，故将蛋白质肽链中的每个氨基酸部分称为氨基酸残基。
每一个氨基酸残基上都有一个R侧链，不同R侧链有不同的性质和功能。
4、多肽链有两端：
具有游离α-氨基的称为氨基末端（N-末端，amino terminal），通常写在肽链的左端；
具有游离α-羧基的称为羧基末端（C-末端，carboxyl terminal），常写在肽链的右端。
多肽链的方向从N-端到C-端，肽链也是从N-端到C-端按氨基酸残基的顺序来命名的。
（二）医学上重要的多肽——生物活性肽
生物体内存在许多游离的活性肽，常称为生物活性肽，它们具有重要的生理功能。
1、谷胱甘肽（glutathione，GSH）
由谷氨酸的γ-羧基与半胱氨酸的氨基形成首个肽键。半胱氨酸的巯基是主要功能团。
GSH的主要功能是保护某些蛋白质的活性-SH不被氧化，同时具有解毒功能。
GSH可以在过氧化物酶催化下，还原体内的过氧化氢生成水，同时本身被氧化。
GSH本身被氧化后后，可以在还原酶作用下在生成还原型GSH。
2、多肽类激素及神经肽
（1）多肽类激素：
催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质素（39肽）、促甲状腺释放素（3肽）。
其中，促甲状腺素释放激素（TRH）结构特殊（焦谷氨酰组氨酰脯氨酰胺）
（2）神经肽（neuropeptide）
一类在神经传导过程中起信号转导作用的肽类。
脑啡肽（5肽）、β-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）。
孤啡肽（17肽）——结构类似于强啡肽。
与神经系统产生痛觉抑制有关，用于临床镇痛治疗。
此外，P物质（10肽）和神经肽Y也属于神经肽。
四、蛋白质的分类
（一）根据蛋白质的组成成分
1、单纯蛋白质——只含有氨基酸。
2、结合蛋白质——除氨基酸外还含有非蛋白质成分（称为辅基）。
辅基的种类：
(1)色素化合物（色蛋白，如：细胞色素C、血红蛋白等）
(2)寡糖（糖蛋白，如：免疫球蛋白等）
(3)脂类（脂蛋白，如：血浆脂蛋白）
(4)磷酸（磷蛋白）
(5)金属离子（金属蛋白，如：血浆铜蓝蛋白、SOD）
(6)核酸（核蛋白，如：核糖体）
（二）根据蛋白质的形状
1、纤维状蛋白
形似纤维，分子的长轴比短轴长10倍以上。
多数为结构蛋白，难溶于水，作为细胞支架，或者连接各细胞、组织和器官。
如：结缔组织中的胶原蛋白（300×1.5nm）。
2、球蛋白
形似球型或椭球型。多可溶于水，具有各种生理活性。
如：酶、转运蛋白、蛋白类激素、免疫球蛋白。
（三）根据蛋白质的物理性质和分离纯化过程（电泳、离心等）进行分类
一般实验室也采用此方法对蛋白质进行分类，但分离出的纯蛋白质仍然需要根据免疫学等生物学性质鉴定才比较满意。
（四）目前有的研究者倾向于根据功能进行分类。
如：酶蛋白、收缩蛋白、调节蛋白、基因调控蛋白、激素蛋白、转运蛋白、保护蛋白、结构蛋白等。
但是，已知多种蛋白质具有多种不同的功能，还有些蛋白质至今功能不清，而且细分蛋白质的功能，似乎是无穷尽的；另一个方面，同种功能的蛋白质又有多种分子结构形态及其性质（同工酶），所以此分类仍然不完善。
也有人试图根据三维结构来分类。
第三节 蛋白质的结构
蛋白质结构的内容：
蛋白质分子中氨基酸的百分组成、氨基酸的排列顺序、肽链空间的特定排布位置。
蛋白质结构的层次：
一级结构、空间结构（二、三、四级结构）。
空间结构又称构象（conformation），是指蛋白质中所有原子在三维空间的排布。
在二、三级结构之间有超二级结构（super secondary structure），或称为标准折叠单位。
并非每种蛋白质都具有四级结构。
一、蛋白质的一级结构（primary structure）
1、蛋白质的一级结构定义：
蛋白质分子中各种氨基酸的排列顺序。
1969年国际纯化学与应用化学联合会（IUPAC）的规定。
2、一级结构的主要化学键是肽键，有些还包括二硫键（-S-S-）。
因共价键的键能大，故蛋白质的一级结构稳定性较强。
注：数字表示半胱氨酸的编号。
3、一级结构的阐明具有重要的意义：
（1）它使人们从根本上认识由于二十种氨基酸排列顺序不同而组成多种多样的蛋白质，并具有不同的生物学功能。
一级结构是蛋白质的基本结构，它决定蛋白质的空间结构。但一级结构不是决定空间结构的唯一因素。
（2）一级结构的测定还应用在临床医学中，许多先天性疾病是由于某一重要蛋白质一级结构发生改变而引起。
因为蛋白质一级结构中氨基酸排列顺序是由基因上的遗传信息（DNA分子中的核苷酸排列顺序——遗传密码）所决定，氨基酸的改变最根本原因是DNA碱基顺序的改变所致，因此研究蛋白质的一级结构有助于从分子水平诊断和治疗遗传病。
二、蛋白质的二级结构（secondary structure）
（一）二级结构的含义：
是指多肽链主链盘旋、折叠形成的主链构象（某一肽段的局部空间结构）。
即多肽链主链各原子在空间的排列方式或相对空间位置，不涉及侧链构象。1、形成蛋白质二级结构基础是肽单元（peptide unit）或肽键平面：
（1）肽键中的C、O、N、H四个原子和与它们相邻的两个α碳原子（反式）都处于同一个平面上，此平面称为肽单元或肽键平面（酰胺平面）。
（2）肽键（C-N）键长0.132nm，介于正常C-N单键（0.149nm）和双键（0.127nm）之间（双键＜肽键＜单键，具有一定双键性质，不能自由旋转。
C-N与C=O结构之间存在共振，可以测出的键长与键角是Ⅰ型和Ⅱ型两种结构的共振杂交体。
（3）Cα与N和羰基C相连接的键是可以自由旋转的单键。
旋转角（双面角）分别用ψ（Cα-N）和j（Cα-C）表示。
双面角都可以在0°—±180°范围内转动，使肽链呈各种不同双面角的主链构象。
当肽链处于充分伸展状态下，两个双面角都是180°。
二者都处于0°则不可能（C=O中的氧原子与N-H中的氢原子间距离小于两者范德华力半径的和（重叠）。
（二）蛋白质二级结构的基本形式（分子模型）
1、α-螺旋（α-helix）——最常见、含量最丰富的二级结构
以肽平面为单位、以α碳为转折形成的稳固的右手螺旋。
2、β-折叠（β-pleated sheet）
β-折叠是蛋白质肽链主链的肽平面折叠呈锯齿状。又称β-片层结构。
该结构的特点如下：
（1） 肽链延伸，肽平面之间折叠成锯齿状（折纸状）。氨基酸残基侧链交替位于锯齿状结构的上下方。
（2）若干条或一条多肽链迂回，形成的若干肽段互相靠拢，平行排列，通过氢键连接。
（3）相邻排列两条β-折叠结构走向相同时，称为顺向平行，反之，称为逆向平行（如图）。
β折叠的形成也有一定的条件。每个锯齿状结构一般比较短（5—8个氨基酸残基）。
3、β-转角（β-turn）——发生在肽链1800回折时的转角
特点：
（1）通常由4个氨基酸残基组成；
（2）首个氨基酸残基的羰基（O）与第4残基的氨基（H）形成氢键；
（3）第2个残基多数是脯氨酸；其他常见的是Gly、Asp、Aln、Trp(色)。
（4）多数处于球蛋白分子表面。
4、无规卷曲（random coil）——描述没有特定规律的那部分肽链结构。
（三）模序（motif）
二个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近形成一个具有特殊功能的空间结构称为模序。
一个模序总有其特征性的氨基酸序列，并发挥特殊的功能。
1、钙离子结合蛋白中的结合钙离子的模序
α螺旋-环-α螺旋3个肽段组成（如下图）。
环中有几个恒定的亲水侧链，侧链末端的氧原子通过氢键结合钙离子。
2、锌指结构（zic finger）
1个α-螺旋和2个反向平行的β-折叠3各肽段组成。形似手指，可以结合Zn2+。
Zn2+可以稳固模序中的螺旋结构，使其能够镶嵌于DNA分子的大沟中。
含锌指结构的蛋白质能与核酸结合。
其它模序结构：
(四)影响二级结构形成的因素
1、蛋白质的一级结构(氨基酸排列顺序)是二级结构的基础
其中氨基酸残基的侧链影响二级结构的形成。
（1）一段肽链中多个酸性氨基酸或对多个碱性氨基酸相邻、集中，同种电荷相排斥，不易形成α-螺旋。
（2）天冬酰胺、亮氨酸的侧链很大，也会影响α-螺旋的形成。
（3）脯氨酸的N原子在钢性环中，无氢原子而不能形成氢键，结果肽链走向转折，不形成α-螺旋。
（4）甘氨酸旋转自由，螺旋不稳定。
（5）形成β-折叠的肽段要求残基侧链较小，才能容纳2条肽段彼此靠近。
2、蛋白质构象的正确形成需要一类称为分子伴侣（chaperon）的蛋白质参加。
（1）分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后分开，防止错误聚集发生，使肽链正确折叠。（蛋白质合成后）。
（2）分子伴侣可以与错误聚集的肽段结合使之解聚，在诱导其正确的构象。
（3）分子伴侣对蛋白质中二硫键的正确形成起重要作用。
三、蛋白质的三级结构（tertiary structure）
（一）蛋白质三级结构的含义：
指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置；
即整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。下图为肌红蛋白的（Mb）三级结构。
（二）蛋白质三级结构的形成与稳定主要靠次级键
疏水作用、离子键、氢键、范德华力（如图）。
1．氢键
多肽链主链之间、主链与极性侧链之间、极性侧链之间都可形成氢键。
2．二硫键
3．离子键又称盐键
是由蛋白质带正电荷的基团和带负电荷的基团形成。
4．疏水基相互作用又称疏水键
是由缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等非极性疏水侧链之间的吸引力，形成的疏水区。
蛋白质三级结构中疏水键的数量最多（最主要），且往往居于球状蛋白质的内部。
（三）结构域（domain）
分子量大的三级结构常可以分割成1个或几个球型或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域。如图。
四、蛋白质的四级结构（quaternary structure）
（一）蛋白质四级结构的含义
蛋白质分子中各个亚基的空间排布以及亚基接触部位的布局和相互作用。
蛋白质的亚基（subunit）：蛋白质分子中具有独立三级结构的多肽链。
含有四级结构的蛋白质分子具有复杂的生物学功能，但是，单独的亚基一般没有生物学功能或功能不完整。
（二）亚基间的结合
蛋白质亚基之间呈特定的三维空间排布，以非共价键连接。
亚基间的结合力主要是疏水作用，氢键和盐键也参与四级结构的维持。
典型的四级结构是血红蛋白（α2β2）：如上图。
2种、4个亚基通过8个离子键连接成四聚体。每个亚基结构相似，都含有一个血红素辅基。功能是运输氧和二氧化碳。
说明
1、在四级结构中，各亚基可以相同或不同。
2、由相同类型的亚基构成的四级结构称均一四级结构。
如过氧化氢酶是由四个相同的亚基构成的。
3、由不同亚基构成的四级结构，称非均一四级结构。
如血红蛋白是由2个α亚基和2个β亚基构成。
第三节 蛋白质结构与功能的关系
蛋白质的结构是蛋白质功能的基础，有什么样的结构则对应什么样的功能，正是蛋白质结构的多样性导致了其功能的多样性。
所以说，蛋白质的结构决定其功能，而蛋白质的功能是其结构的体现。
一级结构与空间结构对维持蛋白质的生物学活性均有重要的作用。
一、蛋白质一级结构与功能的关系
（一）一级结构是构象的基础，构象决定蛋白质的功能。
对于维持蛋白质功能区的特定构象，一级结构中某些氨基酸残基是必需的。
如果这些必需的氨基酸残基发生改变，蛋白质特定构象即被破坏，蛋白质的生物学活性也会丧失。因此，一级结构是空间结构的基础。
蛋白质空间构象被破坏以后，只要一级结构没有破坏，就有可能恢复原来的结构与功能。
如：核糖核酸酶（催化RNA水解的酶），是由124个氨基酸残基组成的单链。
含有8个半胱氨酸组成的4个二硫键：
26-84、40-95、58-110、65-72；（数字是从N-端开始半胱氨酸的编号。）
1、用尿素（或盐酸胍）和β-巯基乙醇处理核糖核酸酶溶液，分别破坏次级键和二硫键；
即：破坏其二、三级结构（变性），不改变其一级结构（肽键不被破坏）。
结果：酶的活性完全丧失。
2、透析除去尿素和β-巯基乙醇；
则变性后松散的多肽链，循其特定的氨基酸顺序重新卷曲、折叠成原来的天然构象，酶的活性也恢复到原来的水平。
3、另外的情况：
（1）还原的核糖核酸酶在8mol/L的尿素中（不去除变性因素）重新氧化时几乎没有酶的活性（仅1%活性恢复）；
此时再透析除去尿素则仅有一小部分酶活性。
原因：
被还原的8个-SH重新被氧化时有105种不同的配对方式，但实际上却只有一种是有活性的核糖核酸酶的天然构象。其余104种构象都是无功能的。
如果在氧化后无功能的核糖核酸酶里面加入痕迹量的β-巯基乙醇，则也可以自发地转变为天然的有活性的核糖核酸酶。此过程大约需要10个小时以上。
实验的结论：
1、空间构象被破坏的核糖核酸酶，只要其一级结构没有被破坏，就可能恢复原来的三级结构，同时恢复其原来的生物学功能。
2、规定核糖核酸酶复杂的三维结构所需要的信息包含在它的氨基酸序列当中。
分子生物学的中心原理：顺序规定构象。
（二）一级结构相似的蛋白，空间构象和功能也相似。
如：不同的哺乳类动物的胰岛素分子的一级结构、构象相似，功能相同。
胰岛素 |
氨基酸序号及其种类（A 、B代表胰岛素的A 、B肽链） |
|||
A5 |
A6 |
A10 |
B30 |
|
| 人 |
Thr（苏） |
Ser（丝） |
Ile（异） |
Thr |
猪 |
Thr |
Ser |
Ile |
Ala |
狗 |
Thr |
Ser |
Ile |
Ala |
兔 |
Thr |
Gly （甘） |
Ile |
Ser |
牛 |
Ala （丙） |
Gly |
Val （缬） |
Ala |
马 |
Ala |
Ser |
Val |
Ala |
羊 |
Thr |
Ser |
Ile |
Ala |
(三)同源蛋白质与分子进化
在不同生物种属中执行同一功能的蛋白质称为同源蛋白质。
对不同生物体的同源蛋白质一级结构的比较研究发现它们之间在氨基酸组成和顺序上有许多不同，即种属差异。
一级结构的种属差异可用以衡量生物进化历程。从不同种属的蛋白质一级结构的氨基酸变异数和替换速度，可以了解种属间的亲缘关系。亲缘关系近的氨基酸差异小。
比较一级结构可以帮助了解物种进化间的关系。
物种越接近，一级结构越相似（氨基酸差异数目小），空间构象和功能越相似。
（四）一级结构与分子病
对于维持蛋白质功能区的特定构象，一级结构中某些氨基酸残基是必需的，如果这些必需的氨基酸残基发生改变，蛋白质特定构象即被破坏，蛋白质生物学活性也可丧失。
由于蛋白质分子发生变异所导致的疾病称为分子病。
但其根本原因在于基因的改变。如：镰刀形贫血的血红蛋白。
HbS = α2β26Glu→Val，β链的第6位谷氨酸→缬氨酸
基因改变（点突变）：
正常HbA的β肽链：
N-val-his-leu-thr-pro-glu-glu-----C（146）
镰型HbS的β肽链：
N-val-his-leu-thr-pro-val-glu-----C（146）
注意：并非一级结构中的所有氨基酸都很重要：
有时蛋白质中的某个或某几个氨基酸的改变都不会影响蛋白质的功能。
有些蛋白质的功能仅与其某部位的特定构象有关，常将这特定构象称蛋白质的功能区。
只要蛋白质功能区的结构完整，分子其它部位改变也不影响蛋白质的功能。
二、蛋白质空间结构与功能的关系
蛋白质的空间结构决定其生物学功能，若用一定方法将其正常空间结构破坏，虽然不破坏其一级结构，活性也可丧失。
（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构——都含有血红素辅基
1、血红素的结构：
血红素由4个吡咯环通过4个甲炔基连接成环，Fe2+位于环中。
血红素中的Fe2+有6个配位键，其中两个与血红素分子平面垂直，并分别与肌红蛋白（或者血红蛋白亚基）F8的His残基的咪唑环上的N及O2结合。
2、肌红蛋白（myoglubin，Mb）结构
60年代借助X射线晶体衍射技术确定了抹香鲸肌红蛋白的构象。
只有三级结构，包括每个氨基酸残基的空间位置。
肌红蛋白三级结构的重要特征是：
（1）肌红蛋白分子结构极为紧密，呈扁平棱形，大小为4.5nm×3.5nm×2.5nm，内部很少空隙。
（2）约有75—80％的主链折叠成α-螺旋构象。全部为右手螺旋。
共有8段长短不一的α-螺旋区：
各分为A、B、C、D、E、F、G、H，不对称地盘曲成层。
其余部分是五个无规卷曲，连接各个α-螺旋：AB、CD、EF、FG、GH；
N-末端和C-末端也是无规卷曲，前者两个残基命名为NA1—NA2，后者五个残基命名为HC1—HC5。
（3）内侧和外侧分明。
分子内部是疏水的空穴，几乎所有疏水侧链都位于空穴周围，绝大多数亲水侧链分布在分子表面，在分子内侧只有两个组氨酸残基（E7、F8），并在活性部位起重要作用。
在分子外侧，极性和非极性残基都有。
（4）血红素位于空穴中，血红素中的Fe2+有6个配位键，其中两个与血红素分子平面垂直，并分别与肌红蛋白F8的His残基的咪唑环上的N及O2结合。
肌红蛋白分子中的疏水区可防止Fe2+被氧化，保证了Fe2+与O2的可逆结合。
3、血红蛋白（henoglubin，Hb）
Hb是具有四级结构的4亚基蛋白（α2β2，每个亚基的结构类似肌红蛋白）：
α链含141个氨基酸残基；
β链含146个氨基酸残基；
4亚基间通过8对盐键结合成紧密亲水的球状蛋白（6.4×5.5×5.0nm）。
4个血红素辅基分别位于分子表面的疏水空穴中，可以结合4分子氧。
Hb四级结构模式图 脱氧Hb亚基内和亚基间的盐键
（二）血红蛋白的构象变化与结合氧
1、百分饱和度（血氧饱和度%）
氧和血红蛋白（Hb）占总Hb的百分数（HbO2/（HbO2+Hb）。
2、氧解离曲线
氧饱和度（%）对氧分压（mmHg）作图所得到的曲线。
Hb和Mb的氧解离曲线分别是S型曲线和直角双曲线。
由图可以看出：
Mb易于和氧结合，在氧分压很低时即可以结合氧气；容易达到饱和。
Hb在氧分压较低（静脉血，释放氧气供组织利用）时与氧的结合较难；
Hb在氧分压较高（动脉血，在肺结合氧气而运输）时与氧的结合较易；
3、协同效应：发生在亚基之间
指第一个亚基与配体结合后，能影响寡聚体中另外亚基与配体的结合能力。有2种：
（1）正协同效应：一个亚基与配体结合后促进其他亚基与配体的结合；
（2）负协同效应：一个亚基与配体结合后抑制其他亚基与配体的结合；
经研究表明：
Hb分子由于4个亚基间的相互作用，四聚体与氧刚开始结合时亲和力远低于肌红蛋白；
分子中的α亚基对氧的亲和力比β亚基大，能首先与第一个氧分子结合，这可导致α亚基构象发生变化，并进而使相邻的β亚基构象也发生改变，增加了β亚基对氧的亲和力。
经实验测定：血红蛋白的第四个亚基与氧的亲和力比第一个亚基大200一300倍。
当血红蛋白结合上第一个氧分子后，它与氧的结合能力由于变构作用会逐次增大，呈现S形结合曲线。
而肌红蛋白仅有一条肽链，没有其他亚基的影响，与氧的亲和力较大，能迅速与氧结合，在很低的氧分压下即接近饱和。
4、Hb正协同效应的理论：
某些蛋白质分子（如：Hb）可与某些小分子物质（如：氧气，称变构效应剂）相互作用，致使构象发生轻微的改变，生物学效应随之发生较大的改变，这种作用称为变构作用或别构效应（allosteric efect）。变构作用是产生协同效应的基础。
变构作用也发生在酶与变构剂、受体与配体之间，因而具有普遍意义。
（1）变构作用及其生理意义
如血红蛋白未与02结合时，其亚基处于某一种空间紧密构象（T构象），与02的亲和力小，在需氧的组织中，血红蛋白呈T构象，致使血红蛋白可以快速的脱氧，供组织利用。
在氧丰富的肺里，血红蛋白转变成疏松构象（R构象），此时与02的亲和力变大。
因此血红蛋白的变构作用对调节血红蛋白运输氧的功能有重要的作用。
Hb的T态转变为R态是通过逐个结合O2完成的
（2）血红蛋白变构机制
血红素Fe2+由于其电子所占外层轨道不同，有高自旋（半径较大）和低自旋（半径较小）两种状态。在脱氧Hb分子中Fe2+处于高自旋状态，半径较大，不能进入叶琳环中央小孔中，位于卟啉环平面大约0.07nm处。
当氧进入α亚基的袋穴与Fe2+结合时，铁原子由高自旋状态变成低自旋状态，半径缩小13％，并向卟啉环方向移动，进入小央小孔。如图：
Fe2+的移动使F8螺旋上的His及F螺旋本身向卟啉环移动；从而引起血红蛋白亚基及整个分子构象的变化。
当血红蛋白一个或两个亚基中的血红素与氧结合后，使足够数量的盐桥断裂，血红蛋白的构象成为R态，其结构松弛，并消除了β亚基E11 Val对血红素袋穴的空间阻碍，使β亚基也能与氧结合。
血红蛋白R态与氧亲和力比T态大数百倍。四级结构的变化：
亚基变化会使α1β1相对α2β2旋转15°，平移0.08nm。
另外，在脱氧状态下β2亚基G1的Asp99的羧基与α1亚基C7的Tyr42的酚基形成一个氢键。
与氧结合后β2亚基相对于α1亚基旋转13.5°，使该氢键断裂，而在β2亚基G4的Asn102的酰胺基与α1亚基G1Asp94的羧基间产生一个新的氢键。
第四节 蛋白质的理化性质及其分离纯化
一、蛋白质的理化性质
（一）蛋白质的两性电离
蛋白质同氨基酸一样，都具有两性解离的特性，因此均为两性电解质：
1、蛋白质分子中肽链的两个末端，有可解离的α-氨基α-羧基。
2、更主要的是侧链上有不少的基团，在一定pH条件下可以解离成带正电或负电的基团。
（1）解离后可带正离子的基团：
赖氨酸残基的ε-氨基；精氨酸残基的胍基；组氨酸残基的咪唑基
（2）解离后可带负离子的基团：
谷氨酸残基γ羧基；天冬氨酸残基的β羧基
3、蛋白质的等电点（pI）
当蛋白质处于某一pH值的溶液中时，蛋白质分子上所带的正、负电荷相等，净电荷为零，蛋白质为兼性离子。此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点（isoe1ectric point，pI）。
等电点是蛋白质的特征性常数。各种蛋白质有各自的等电点。
注意：
（1）蛋白质的等电点并不是蛋白质的电荷最小时的pH。
处于等电点的蛋白质，其电荷可能比在偏酸或偏碱时的电荷数还更多；但是其正负电荷必相等，其净电荷一定为零。
（2）测定蛋白质等电点必须在有一定离子强度的适当缓冲液中进行。
在离子存在的情况下，蛋白质的部分电荷必然被缓冲剂离子的相反电荷所中和，使蛋白质在电场中的行为改变。当溶液的离子强度有所改变时，蛋白质在电场中的移动必随之改变，其等电点亦必相应改变（因为等电点是蛋内质在电场中不移动或移动最小时的PH），所以：在陈述蛋白质等电点时，应当说明测定时所用缓冲剂的种类、离子强度和缓冲液的pH值，否则是不够正确的。
（3）在水溶液中蛋白质的等电点一般是偏酸的，这主要是因为这些蛋白质的羧基解离度比氨基解离度大的关系。
在等电点时蛋白质比较稳定、其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小
（二）蛋白质的胶体性质
分子量：1—100万，颗粒大小：1—100nm，在水溶液中吸引水分子形成水化膜，形成稳定的胶体。稳定因素有二：水化膜和电荷。
1、在蛋白质表面有亲水基团，能与水发生水合作用，水分子受蛋白质极性基团的影响，定向排列在蛋白质分子的周围，形成水化层，将蛋白质颗粒分开，不致相聚而沉淀。
2、蛋白质在偏离等电点的溶液中，形成电荷层，同性电荷相斥，防止蛋白质颗粒相聚沉淀。
如果破坏水化膜和电荷，蛋白质则因分子间引力聚集而沉淀。
（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固
1、蛋白质的变性（denaturation）
蛋白质在某些理化因素影响下，其特定空间结构破坏而导致理化性质改变和生物学活性丧失，这种现象称蛋白质的变性。
注意：变性往往伴有功能的改变，但是功能的改变不一定就是变性。
（1）使蛋白质变性的物理因素有
高温、高压、超声波、紫外线、x射线等。
使蛋白质变性的化学因素有：强酸、强碱、浓乙醇、重金属、尿素、去污剂等。
（2）变性的本质
一般认为：
蛋白质变性只破坏二硫键和次级键。
蛋白质变性时，空间结构剧烈变化，而不涉及肽键的断裂，因此一级结构并未破坏。
即蛋白质变性的实质是维系蛋白质空间结构的次级键破坏。
（3）变性后性质的改变
蛋白质变性后：
溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失、容易被蛋白酶水解、容易沉淀。
2、蛋白质的沉淀及其与变性的关系
沉淀是变性蛋白质从溶液中析出的一种现象。
变性的蛋白质易沉淀。条件是变性蛋白质溶液的pH接近蛋白质的等电点。
变性蛋白质溶液的pH远离其pI，此时蛋白质仍不易沉淀。
注意：有时蛋白质发生沉淀，但是并不变性。
3、蛋白质的凝固作用（protein coagulation）及其与变性的关系
天然蛋白质或等电点状态的变性蛋白质经加热煮沸，多肽链相互缠绕，即可变为较坚固的凝块，这种现象称为蛋白质凝固作用。
凝固是蛋白质变性以后进一步发展的不可逆的结果。
4、变性蛋白质的复性（renaturation）：
有些蛋白质变性后，如设法将变性因素除去，该变性蛋白质尚能恢复其空间结构与活性，称为蛋白质的复性。下图：牛胰核糖核酸酶的变性与复性。
变性的蛋白质是否复性，主要取决于变性程度。凝固的蛋白质是不能复性的。
大多数蛋白质变性后，不能恢复其天然状态。称为不可逆变性。
变性有其有利的一面，也有不利的一面：
如在临床上用高温、高压、紫外线、75％酒精消毒，那是利用了这些变性因素使细菌、病毒的蛋白质变性，从而失去致病作用。
另外，在蛋白质的制备过程中，如果提取的目的蛋白对热稳定，可用热变性的方法很方便地除去其他杂蛋白。对于不利的变性则应该尽量避免。
（四）蛋白质的紫外吸收性质
主要来自Trp和Tyr对于280nm紫外光的吸收。
可以对蛋白质进行定性与定量的分析。
（五）蛋白质的呈色反应
蛋白质分子中，肽键及某些氨基酸残基的化学基团，可与某些化学试剂反应显色，称为蛋白质呈色反应。利用这些呈色反应可以对蛋白质进行定性、定量测定
1、茚三酮反应
同氨基酸一样具有游离氨基。蛋白质分子的α-游离氨基与茚三酮反应产生蓝紫色化合物（同氨基酸）；
2、双缩脲反应
双缩脲反应：肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热呈现紫色或红色的反应。
氨基酸无此反应，可以检测蛋白质的水解程度。
双缩脲是2分子脲加热产氨、缩合的产物，凡是有2个或2个以上肽键结构的化合物都有双缩脲反应。
3、酚试剂反应：
蛋白质分子中酪氨酸的酚基与酚试剂作用，生成蓝色化合物。
二、蛋白质的分离纯化
（一）有机溶剂（丙酮、乙醇等）沉淀和盐析
（二）电泳
（三）透析与浓缩
（四）层析
（五）离心技术
三、多肽链中氨基酸的序列分析
分析原则基本依据Sanger的方法（1947-1953），并加以改良，同时借助于现代化的分析一起进行。
基本原理和步骤：
（一）分析已经纯化的蛋白质的氨基酸组成
蛋白质用盐酸水解，离子交换树脂分离氨基酸并定量，计算氨基酸的组成百分比
（二）测定多肽链的2个末端氨基酸种类
1、氨基末端：二硝基氟苯（DNFB）或丹黄酰氯（结合衍生、水解分离、鉴定）
2、羧基末端：羧肽酶
（三）把肽链水解成小片段（定点裂解），分别分析。
用具有特异位点的蛋白酶或化学试剂：
1、胰蛋白酶——碱性氨基酸（Lys、Arg）羧基形成的肽键。
2、胰凝乳蛋白酶等——芳香族氨基酸（Phe、Tyr、Trp）羧基形成的肽键
3、溴化氰等——Met羧基侧肽键。
水解后肽段层析分离并鉴定，确定肽段的数目。
（四）测定各个肽段的氨基酸排列顺序
Edman降解法：
最早用来测定N-端氨基酸，后来用于测定从N-端到C-端短肽的顺序。
Edman降解法——基本原理包括三步反应：偶联、裂解、转化
（1）偶联：在PH8—9条件下：
多肽链N-末端氨基酸的氨基与异硫氰酸苯酯（C6H5-NCS，PITC）试剂偶联（加成）；
生成苯异硫甲氨酰基-肽，又称为苯氨基硫甲酰基肽（C6H5-N（H）CS-n肽，PTC-多肽）
注：PITC只与氨基末端的游离α-氨基作用。
（2）裂解：在无水、强酸条件下；
靠近PTC基的氨基酸环化、肽链断裂；
形成苯氨基噻唑啉酮—氨基酸（ATZ—氨基酸）和一个失去末端氨基酸的肽链。
此肽链的N-端仍然是游离氨基。
（3）转化：ATZ-氦基酸不稳定；
在三氟乙酸水溶液条件下可转化成稳定的乙内酰苯硫脲—氨基酸（PTH—氨基酸）；
即N-末端第一个氨基酸，此氨基酸可以用层析方法鉴定
PTH-氨基酸可以通过薄层层析、气相层析、高效液相层折及质谱等方法进行鉴定。
由于高效液相层析技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确等特点，并且仪器自身结构也日臻完善，近年来得到广泛应用。
反应步骤：
1）PITC + n肽 → PTC-n肽（pH8-9条件下，PITC只与肽游离氨基作用）
2）PTC-n肽 → ATZ-aa + （n-1）肽（无水、强酸的条件）
3）ATZ-aa → PTH-aa （在三氯醋酸的水溶液中进行，后者稳定。）
（五）确定完整肽链的顺序
组合对比，最终得出肽链中氨基酸的顺序。两种方法：重叠法、接头肽法。
1、重叠法：从小肽的重叠建立氨基酸的排列顺序要按下述原则：
即将各段小肽按一定顺序排列，将各个样品中相同的氨基酸残基位置对准重叠排列。
|
肽 片 段 |
A-1 |
A |
F |
|
|
|
|
|
|
|
|
B-1 |
A |
F |
G |
R |
|
|
|
|
|
|
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A-2 |
|
|
G |
R |
L |
Y |
|
|
|
|
|
B-2 |
|
|
|
|
L |
Y |
K |
W |
|
|
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A-3 |
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|
|
|
|
|
K |
W |
|
|
|
B-3 |
|
|
|
|
|
|
|
W |
H |
S |
|
A-4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
H |
S |
|
10肽顺序 |
A |
F |
G |
R |
L |
Y |
K |
W |
H |
S |
|
2、结头肽法：
先选用切点少的断链方法，得到—些大的肽段，然后再选用切点比较多的断链方法，得到一套比较小的肽段。
两种断链方法没有相同的切点：
第二套比较小，有许多肽段正好跨过第一套肽的切口，称作结头肽，其作用是将第一套肽段正确连接起来，建立蛋白质的一级结构。
ABCDEF GHIJKLMNOP QRSTUVW 三个大肽段
EF GHI NOP QRS 结头肽
新的蛋白质测序方法：通过核酸序列推演蛋白质的序列。
（1）分离编码蛋白质的基因，做基因DNA测序；
（2）排出mRNA序列
（3）查密码表推出氨基酸的序列。
目前多数蛋白质的氨基酸序列都是通过此方法获得的。
