组织学绪论

三、组织学的研究方法

组织学的研究方法很多，在应用中要根据研究的目的和内容，选用相应的方法才能获得预期的效果。这里仅就最常用、最基本的一些方法作简要介绍。
(一)常用光镜标本制作技术
光学显微镜的分辨率为0.2μm，放大倍数为1500倍左右，最大可达15000倍。
1．涂片、铺片与磨片标本的制备
涂片法是常用的一种方法，如血液等可直接涂于载玻片上，制成涂片标本，干燥后进行固定、染色及封固。
铺片法用于疏松结缔组织、神经等柔软组织和肠系膜等薄层组织，可将其铺于载玻片上，撕开，展平制成铺片标本，待干燥后进行固定染色。
磨片法用于坚硬组织的标本制作，如骨和牙等坚硬组织除用酸如稀硝酸、脱钙后再按常规制成标本外，也可以直接将其磨成薄的磨片标本进行观察。
2．切片标本的制备 观察机体各部的微细结构时，首先要将其制成切片标本，其中以石蜡切片最为常用。其制备程序大致如下：
①取材与固定：取材要尽量以人体材料为主，辅以动物材料；取得新鲜材料后，将其切成适当的小块1.0cm3、立即投入固定剂中进行固定，使组织中蛋白质迅速凝固，防止组织自溶或腐败，以保持生活状态下的结构。常用的固定剂有甲醛、酒精、醋酸、苦味酸、锇酸等等。
②脱水、透明与包埋：把固定好的材料用乙醇将组织内的水分脱掉，经二甲苯透明后，再浸入已融化的石蜡中进行浸透、石蜡包埋。
③切片与染色：用切片机切成5～l0μm的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行染色，最常用的染色法是苏木精和伊红染色，简称h-e染色。
配制后的苏木精染液呈碱性，可使细胞核内的染色质及细胞质内的核糖体等染成蓝紫色，称嗜碱性；伊红染液呈酸性，可使多数细胞的细胞质染成粉红色，称嗜酸性；对碱性和酸性染液亲和力都不强的，称为中性。
④封固：切片经脱水、透明后，于切片上滴加中性树胶和盖片进行封固，贴标签备用。
除h-e染色外，还有多种染色方法。有的能特异性的显示细胞内某些结构，弹性染色显示组织内的弹性纤维；细胞经重铬酸盐处理后，呈棕褐色，称嗜铬性；组织成分经硝酸银处理后，显示亲银性；肥大细胞中的颗粒经甲苯胺蓝等碱性染料染色后，呈紫红色，显示异染性。
除石蜡切片外，在制作较大结构如眼球、睾丸等、的切片时，常用火棉胶包埋法；骨和牙等坚硬的组织，可用弱酸稀硝酸、脱钙后，用石蜡或火棉胶切片法制成切片标本；还有，为了较好的保存细胞内酶的活性或尽快制成标本的需要，可选用冷冻切片，它是将组织在低温下快速冻结，直接切片后进行染色，或将组织块置入液氮中—196℃、快速冷冻，用恒冷箱切片后进行染色。

(二)几种特殊显显微镜
1．相差显微镜
1)、用途：相差显微镜是用于观察生活细胞和未经染色细胞的形态结构。生活细胞无色透明，细胞内各种结构间的反差很小，故在一般光学显微镜下难以观察到细胞的轮廓及内部结构，必须使用相差显微镜。
2)、显微镜结构特点：
①装有不同大小环状光阑的聚光器。
②物镜内装有位相板。
③中心望远镜装置。
3)、相差显微镜的基本原理：把透过生活标本可见光的相位差变成振幅差，从而增强了标本内各种结构之间的反差，使标本中生活细胞的结构清晰可辨。
4)、倒置相差显微镜：
① 用途：若观察生长在培养瓶中的生活细胞时，对体外培养细胞进行长时间观察、拍照、摄电影及录像等以记录生活细胞的行为。
② 原理：与相差显微镜的原理基本相同，它的特点是将显微镜的物镜安装于载物台的下方，光源及长焦距集光器安装于载物台的上方。

2．干涉微分相差显微镜
干涉微分相差显微镜的基本原理与相差显微镜非常相似，但它有一个装有分光器的聚光器，利用分光器将光束分为两组，一组光束通过被检物，另一组光束则通过周围介质，旋转检偏器，使光的干涉形成光程差，可随检偏器的旋转，两光束形成不同角度的交叉，于是被检物呈现出不同颜色，致使生活细胞如同染上颜色一样，故又称为光染色。它与相差显微镜相比，除有鲜艳的颜色外，在细胞周围不出现明亮的晕环。

3．荧光显微镜
1、用途：荧光显微镜可以观察荧光染色本身具有荧光的组织细胞结构及细胞内某些成分的分布和含量的变化，并探讨细胞的功能状态，或应用荧光素标记免疫球蛋白，进行免疫荧光细胞化学研究。
2、原理：它是装有能产生紫外线短波长、光源及系列滤片装置的显微镜。由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光，如维生素a呈绿色荧光、心肌细胞内脂褐素呈棕黄色至金黄色的荧光；但是细胞内的某些成分只有与荧光素结合后，在紫外线的照射下，才可呈现一定颜色的荧光，如应用吖啶橙荧光素、处理细胞后，细胞核内的dna呈绿至黄绿色荧光，细胞质及核仁内的rna呈橘黄至橘红色荧光。

4．暗视野显微镜
1、用途：该显微镜适用于观察细胞内微小颗粒，例如线粒体、细菌运动等。
2、结构和原理：暗视野显微镜的特点是该显微镜具有暗视野聚光器，使光线不直接进入物镜，故呈暗视野。利用丁达尔现象观察微小颗粒。

5．共聚焦激光扫描显微镜
共聚焦激光扫描显微镜是20世纪80年代初研制成功的一种高灵敏度、高分辨率的新型仪器。
1、结构特点与原理是：
①以激光作为光源。
②采用共聚焦成像系统和电子学系统。
③扫描、显示及 记录系统。
激光具有发散角小、方向性好的优点，光束通过聚焦后落在样品如细胞等、 的不同深度；在不同方向、不同深度的平面上进行聚焦扫描，从而得到一系列不同层次的清晰图像，平面间隔最小约600~800nm；微机图像合成系统进行细胞的三维结构重建。
2、用途：可对细胞进行体视学的定量分析研究；clsm可以更精确地检测、识别组织和细胞内的微细结构及其变化。由此，clsm又有细胞ct之称。

(三)电子显微镜技术
目前，电子显微镜已成为研究机体微细结构的重要手段。用于电子显微镜下观察，常用的测量单位是纳米。电子显微镜的分辨率为0.1~0.2nm，放大倍数为几万倍，最大可达几十万倍。常用的电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显微镜。与光镜相比，电子显微镜是应用电子束代替了可见光，应用电磁透镜代替了光学透镜，并使用荧光屏将肉眼不可见的电子束成像。
1．透射电镜术
原理：透射电镜技术是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。必须制备超薄切片，用戊二醛和锇酸进行双重固定、树脂包埋，用超薄切片机切超薄切片，经醋酸铀和枸橼酸铅等电子染色。电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子散射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电镜照片上则呈黑色，称电子密度高；反之，则称为电子密度低。
2．扫描电镜术
原理：扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体细胞、组织、表面的立体图像，可摄制成照片。扫描电镜样品用戊二醛和锇酸等进行固定，经脱水和临界点干燥后，再于样品表面喷镀薄层金膜，以增加二次电子数。扫描电镜能观察较大的组织表面结构，由于它的景深长，1mm左右凹凸不平的表面也能清晰成像，故样品图像富有立体感。
3．冷冻蚀刻复型术
1、用途：冷冻蚀刻复型术是电镜样品的一种制备技术，以显示细胞、组织微细结构的立体构象。是研究膜结构与功能的关系的重要手段。
2、样品制备步骤和原理：
①冷冻：先把组织浸入含有20％～30％甘油生理盐水的冷冻保护剂中，以防止冰晶形成和提高冷冻速度，然后把组织放人液氮—196℃、内快速冻结。
②断裂：在低温真空内，把冻结的组织用钢刀劈开，断裂面常为组织、细胞的薄弱部位，如膜的双层类脂质分子的疏水极之间，余下部分的表面是要观察的部位。
③蚀刻：在真空内将温度回升到—100℃，使断裂面的冰晶升华，形成凹凸不平的形态。
④复型：在断裂面以45o角喷镀一层铂膜，以增加图像的反差和立体感，再喷镀一层碳膜以加固铂膜。然后用次氯酸钠等腐蚀液除去组织，捞取复型膜在透射电镜下观察组织结构断面的立体图像。

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